Световая микроскопия

Устройство для наблюдения
методом фазового контраста КФ-5

Техническое описание и инструкция по эксплуатации КФ-5

1. НАЗНАЧЕНИЕ

Устройство для наблюдения методом фазового контраста КФ-5 предназначается для исследования малоконтрастных объектов, невидимых в микроскопе при обычных условиях наблюдения. В отличие от устройства КФ-4 в объективе устройства КФ-5 и в его конденсорной диафрагме имеются два кольца.

Устройство КФ-5 устанавливается на микроскоп вместо обычного конденсора.

Устройство изготавливается в исполнении У категории 4.2, т.е. для работы в макроклиматических районах с умеренным климатом в лабораторных помещениях при температуре воздуха от +10 до +35°С, и в исполнении Т категории 4.2, т.е. для работы в макроклиматических районах как с сухим, так и с влажным тропическим климатом в лабораторных помещениях при температуре воздуха от +10 до +45°C.

2. ТЕХНИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ

3. СОСТАВ УСТРОЙСТВА

В состав устройства для наблюдения методом фазового контраста входят устройство с фазовым конденсором, фазовые объективы и вспомогательный микроскоп.

Полный комплект устройства указан в его паспорте.

4. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ И РАБОТА УСТРОЙСТВА

В микроскопе возникает изображение вследствие дифракционных явлений света. Препарат для микроскопирования рассматривается как решётка с регулярной структурой, например, как попеременно идущие тёмные и светлые линии, расположенные на одинаковом расстоянии одна от другой. В результате дифракции свет, проходя через такую решётку, идет не только по своему первоначальному направлению, но и отклоняется в других направлениях под определенными углами к первоначальному. Эти углы будут тем больше, чем тоньше структура препарата.

Схематически ход лучей показан на рис. 1. Свет, исходящий из центра апертурной диафрагмы ЕР, проходит через конденсор К микроскопа, выходит из него параллельным пучком и падает па объект О, представляющий собой решетку. После этого свет идет в объектив по своему первоначальному направлению и, кроме того, вследствие дифракции отклоняется в направлениях ±1 и ±2, как показано на рисунке пунктирными линиями. Эти пучки лучей собираются в фокальной плоскости AP объектива, где получается изображение апертурной диафрагмы конденсора, которое в точке О' образовано лучами, прошедшими объект без отклонения, а в токах ±1 — отклонёнными лучами. Таким образом, в фокальной плоскости объектива получается так называемый «дифракционный спектр».

Пучки лучей, идущие от дифракционного спектра, собираются в плоскости изображения О", где вследствие их интерференции образуется изображение объекта О. Это изображение возникает только в том случае, если объектив пропускает хотя бы один первый дифракционный максимум, кроме нулевого максимума.

Дифракционный спектр можно увидеть, если вынуть окуляр и смотреть в тубус микроскопа. При этом в случае отсутствия препарата будет видна картина, изображенная на рис. 2, а при наличии препарата в виде решетки — картина, изображенная на рис. 3.

Интенсивность центрального максимума значительно сильнее интенсивности боковых максимумов, которые будут тем слабее, чем выше номер максимума. Центральный яркий максимум возникает от лучей, идущих без отклонения. Боковые максимумы возникают от лучей, отклоненных на границе между темными и светлыми штрихами решетки.

Распределение интенсивности в дифракционном спектре зависит от соотношения ширины светлых и темных лучей, а также от оптической их плотности.

В микроскопии различают два вида объектов.

1. Объекты с различным светопоглощением на разных участках. Такие объекты изменяют интенсивность прошедшего через них света, т. е. изменяют величину амплитуды колебания света, и поэтому называются «амплитудными». К таким объектам относятся все окрашенные препараты; изображаются они с большим или меньшим контрастом.

2. Объекты с одинаковым светопоглощением на различных участках, но с различной оптической толщиной. Такие объекты не изменяют интенсивности прошедшего через них света, а изменяют лишь фазу его колебания. Изменение фазы колебания не может быть замечено глазом или заснято на фотопластинку, поэтому такие объекты невидимы, и их принято называть «фазовыми». Фаза колебания света, прошедшего через объект, изменяется пропорционально оптической толщине препарата. К фазовым препаратам относятся все неокрашенные неконтрастные препараты.

Фазовую решётку можно рассматривать как дифракционную решетку, которая состоит из чередующихся полос и щелей с одинаковым светопропусканием. но с различной оптической толщиной.

Фазовая решетка изображена на рис. 4. Такая решетка вызывает изменение фазы в свете, проходящем через щели, по отношению к свету, проходящему через выступы. При прохождении света через фазовую решетку, как и в случае прохождения через дифракционную решетку, будет наблюдаться дифракция света; в фокальной плоскости объектива образуется дифракционный спектр, который будет отличаться от дифракционного спектра амплитудной решетки интенсивностью центрального максимума (он будет ярче) и разностью фаз между нулевым и боковыми максимумами.

По дифракционной теории в плоскости изображения О" (см. рис. 1) образуется изображение, подобное объекту, а так как объект был взят неконтрастный (невидимый), то и изображаться он будет в виде равномерного белого ноля.

С помощью метода фазового контраста возможно получение контрастного изображения в плоскости изображения О", в котором распределение интенсивности света будет соответствовать распределению фаз в объекте, и невидимые объекты станут видимыми. Как показали теория и опыт, это вполне возможно. Необходимо только, чтобы дифракционный спектр, даваемый фазовой решеткой, был подобен дифракционному спектру амплитудной решетки. Для этого нужно изменить на 90° разность фаз между нулевым и боковыми максимумами и понизить интенсивность нулевого максимума. Следовательно, в фокальной плоскости объектива нужно поместить пластинку, которая перекрыла бы центральный максимум, уменьшила его интенсивность и изменила фазу на 90°.

Принцип действия устройства поясняется на рис. 5. Здесь О1ОО2 — объект, представляющий собой комбинацию щели О и выступов О1 и О2. Амплитуда колебания света изображена в виде вектора, величина которого определяет интенсивность света, а направление — фазу колебания. На объект падает пучок света с амплитудами А, А1 и А2, соответственно на щель и два соседних выступа. Если взят фазовый препарат, то интенсивность света, прошедшего через него, не изменяется, а следовательно, не изменяется и величина векторов А, А1 и А2.

Вектор А, пройдя через щель, не изменяет ни своей величины, ни фазы: векторы А1 и А2, оставаясь неизменными по величине, изменяют своё направление, как показано на рисунке над выступом решетки. Изменение направления векторов тем меньше, чем меньше будет разность хода, которая возникает в месте щели и выступа вследствие различной толщины объекта. Векторы А1 и А2 над выступом решетки можно разложить на две составляющие по правилу параллелограмма, выбрав направление и величину одного из них такими же, как и у вектора над щелью. Тогда вторая составляющая, незначительная по величине, будет составлять с первой составляющей угол, близкий к 90° и увеличивающийся по мере увеличения разности хода. На рисунке эти составляющие показаны векторами а1 и а2.

Векторы А1, А2 и А, обозначенные в плоскости АР векторами А1', А2' и А', будут участвовать в образовании нулевого максимума, а векторы a1 и a2, обозначенные в той же плоскости векторами а1' и а2' — в образовании боковых максимумов +1 и —2.

В плоскости АР помещена фазовая пластинка FP, которая перекрывает нулевой максимум, уменьшает его интенсивность и изменяет фазу колебания на 90°.

Состояние света, образующего нулевой максимум, после прохождения через фазовую пластинку будет изображаться векторами A1", A", A2", которые повернуты на 90° по отношению к векторам А1', A', A2' и по величине меньше их в два раза. Согласно дифракционной теории в плоскости О2'О'О1' образуется изображение объекта. В точку О' приходит свет, прошедший через нулевой максимум от щели с амплитудой A''', а в точки O2' и O1' — свет, прошедший через нулевой максимум от выступа и боковые максимумы соответственно с амплитудами A2" и а2' А1" и а1'. Эти векторы необходимо сложить по правилу параллелограмма, в результате чего получатся векторы А2''' и А1'''. Сравнивая их по величине с вектором А''' видим, что они меньше этого вектора, а это значит, что в плоскости О2'О'О1' в различных местах будет различная интенсивность света. В точке О' освещенность будет больше, чем в точках O2' и O1', соответствующих более толстой части препарата.

В зависимости от того, опережает ли свет, прошедший через фазовое кольцо, по своей фазе свет, прошедший мимо кольца, или отстает от него, получается либо позитивный фазовый эффект, либо негативный. В первом случае частицы объекта с большей оптической толщиной будут темнее частиц с меньшей оптической толщиной, а во втором случае — наоборот.

Таким образом, в поле зрения микроскопа будет видно изображение структуры решетки, в которой распределение интенсивности соответствует изменению фаз колебания. Как было сказано, для получения контраста необходимо изменить разность хода нулевого максимума, не изменяя разности хода боковых максимумов. При использовании диафрагмы и фазовой пластинки в виде круга это не представляется возможным, так как нулевой и боковые максимумы перекрывают друг друга (см. рис. 3). Поэтому диафрагма и фазовая пластинка выбираются в виде кольца; при такой форме диафрагмы и фазовой пластинки перекрытие получается минимальным и практического значения не имеет.

На рис. 6 показано изображение, наблюдаемое в тубус микроскопа при использовании кольцевой диафрагмы конденсора и фазовой пластинки в виде кольца при отсутствии препарата, а на рис. 7 — при тех же условиях при наличии препарата.

Общий вид устройства КФ-5 показан на рис. 8.

Основными частями устройства КФ-5 являются фазовые объективы 1, фазовый конденсор 2 и вспомогательный микроскоп 3.

4.1. Фазовые объективы

Объективы, входящие в комплект устройства КФ-5, рассчитаны на длину тубуса 160 мм и толщину покровного стекла 0,17 мм. Технические данные объективов указаны в табл. 1.

Фазовые объективы для наблюдения методом фазового контраста отличаются от обычных ахроматических объективов тем, что в плоскости выходного зрачка объектива имеются два концентричных фазовых кольца: одно — широкое, другое, нанесенное внутри широкого кольца, — узкое. С помощью колец изменяется фаза нулевого максимума на 90" и уменьшается его интенсивность. Фазовые кольца (рис. 9) нанесены на внутренней поверхности одной из склеенных линз (или на пластинке), расположенной около выходного зрачка объектива.

На колпачке таких объективов, помимо обычной гравировки, награвировано «Ф-2». Пользоваться этими объективами при обычных исследованиях не рекомендуется, так как они дают пониженное качество изображения вследствие наличия фазовых колец.

4.2. Фазовый конденсор

Фазовый конденсор 2 (см. рис. 8) для наблюдения методом фазового контраста по оптической схеме аналогичен обычному конденсору. Исключение составляют диафрагмы с двумя кольцами, помещённые в фокальной плоскости фазового конденсора. Диафрагмы вставляются в револьверный диск 4 и применяются в соответствии с выбранным объективом.

Конденсор может применяться и для наблюдений обычным способом. Для этого в диске револьвера, кроме кольцевых диафрагм, имеется свободное отверстие для пропускания всего пучка света, а под револьверным диском — ирисовая диафрагма. Фазовый конденсор вставляется в конденсородержатель микроскопа и зажимается винтом обычным способом.

Смена кольцевых диафрагм производится поворотом револьверного диска за накатанную часть до фиксации; при этом в окне кожуха конденсора должна появиться цифра, соответствующая увеличению применяемого объектива, или «0», соответствующий свободному отверстию. Два винта 5 служат для центрировки кольцевой диафрагмы относительно фа юного кольца объектна. Кольцо 6 предназначено для открывания ирисовой диафрагмы, а винты 7 для ее центрировки относительно фазовых колец объектива.

Откидная оправа 8 служит для установки светофильтра.

4.3. Вспомогательный микроскоп

Вспомогательный микроскоп 3 применяется при центрировке изображения кольцевой диафрагмы конденсора относительно фазовых колец объектива. Вспомогательный микроскоп вставляется в тубус микроскопа на место окуляра и по выполнении центрировки снова заменяется окуляром. Вспомогательный микроскоп состоит из патрубка с объективом и патрубка с окуляром. Патрубок с окуляром вставляется в патрубок с объективом и может перемещаться в нем; стопоренне в любом положении осуществляется винтом 9.

6. ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ И ПОРЯДОК РАБОТЫ

6.1. Распаковка устройства

6.1.1. Распаковывайте устройство, внесенное в помещение, только после того, как оно примет комнатную температуру.

6.1.2. Освободите находящиеся в укладочном ящике устройство и его принадлежности от упаковочной бумаги.

6.1.3. Проверьте комплектность устройства по прилагаемому к нему паспорту.

6.1.4. Произведите осмотр принадлежностей и устройства и убедитесь в отсутствии повреждений.

После этого можно приступить к установке устройства на микроскоп.

6.2. Работа с устройством

6.2.1. Вставьте в револьвер микроскопа фазовоконтрастные объективы 1, а в тубус микроскопа— выбранный окуляр.

При применении объективов 70x1,23 и 90x1.25 для полного использования апертуры конденсора нанесите на плоскую поверхность его фронтальной линзы каплю иммерсионного масла или воды.

6.2.2. Установите вместо обычного конденсора фазовый конденсор 2; при этом револьверный диск 4 должен быть повернут так, чтобы в окне кожуха была видна цифра 0. Фазовый конденсор может постоянно оставаться на микроскопе, так как он годен и для обычных наблюдении в проходящем свете.

6.2.3. Поместите препарат на столик микроскопа и сфокусируйте на него микроскоп.

6.2.4. Установите осветитель по правилам нормального освещения; при этом нить лампы осветителя должна изображаться в плоскости ирисовой диафрагмы конденсора, а полевая диафрагма— в плоскости препарата. Полевая диафрагма должна быть отцентрирована по отношению к полю зрения объектива и открыта в соответствии с полем зрения окуляра.

6.2.5. Откройте с помощью диска 6 полностью ирисовую диафрагму конденсора.

6.2.6. Вставьте вместо окуляра вспомогательный микроскоп 3 и, перемещая его окуляр, сфокусируйте микроскоп на фазовые кольца объектива (см. рис. 9).

6.2.7. Вращением револьверного диска кон денсора включите нужную кольцевую диафрагму, при этом в окне кожуха конденсора должна появиться цифра, соответствующая выбранному объективу. Теперь во вспомогательном микроскопе будет видно помимо фазовых колец изображение светлых колец диафрагмы конденсора (см. рис. 10).

6.2.8. Совместите с помощью центрировочных винтов 5 (см. рис. 8) изображение светлых колец диафрагмы с фазовыми кольцами (см. рис.11) и отцентрируйте с помощью винтов 7 (см. рис. 8) ирисовую диафрагму конденсора относительно фазовых и светлых колец.

6.2.9. Снимите вспомогательный микроскоп и замените его выбранным окуляром.

6.2.10. Наблюдайте за объектом сначала с двумя фазовыми кольцами, а затем, закрыв ирисовую диафрагму конденсора, перекройте широкое кольцо и ведите наблюдение только с внутренним узким кольцом. Такой метод наблюдения дает более достоверное представление о структуре исследуемого объекта.

Для большего эффекта метода фазового наблюдения рекомендуется пользоваться зеленым светофильтром, входящим в комплект микроскопа.

Следует помнить, что после каждой смены объектива или препарата необходимо заново проверять центрировку кольцевых диафрагм по отношению к фазовым кольцам, так как только в этом случае можно быть уверенным в надлежащей контрастности объекта; неточное совмещение колец ведет к снижению контрастности.

Для перехода к наблюдению обычным способом в светлом поле достаточно переключить револьвер конденсора на цифру «0». При этом следует помнить, что при работе в светлом поле фазовые объективы дают некоторое ухудшение качества изображения.

7. ВОЗМОЖНЫЕ НЕИСПРАВНОСТИ И ИХ УСТРАНЕНИЕ

Неисправность	Вероятная причина	Способ устранения
Поле зрения неравномерно освещено, появляются темные пятна	Неправильно установлен конденсор — полевая диафрагма изображается не в плоскости объекта	Перемещая фазовый конденсор по высоте, добиться резкого изображения полевой диафрагмы в поле зрения объектива
После включения кольцевой диафрагмы поле зрения микроскопа становится темным	Закрыта ирисовая диафрагма конденсора	Полностью открыть диафрагму
Недостаточная контрастность изображения	Плохая центрировка кольцевых диафрагм по отношению к фазовым кольцам объектива; включена не та диафрагма	Произвести заново центрировку и проверить соответствие диафрагмы установленному объективу

8. ПРАВИЛА ОБРАЩЕНИЯ С УСТРОЙСТВОМ, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ

8.1. Правила обращении с устройством

При получении устройства КФ-5 следует обратить внимание на сохранность упаковки и пломбы.

Устройство выпускается тщательно проверенным, и для обеспечения безотказной работы надо содержать его в чистоте и предохранять от повреждений. Особое внимание следует обращать на чистоту оптических деталей, прежде всего объективов. Пыль с оптических поверхностей нужно смахивать беличьей кистью, а жировые налеты удалять мягкой тряпочкой или ватой, смоченной чистым бензином или ксилолом. Разбирать объективы для чистки самим нельзя; следует отправить их для этого в оптическую мастерскую.