Поляризационно-интерференционный микроскоп BIOLAR
(Техническое описание и инструкция по эксплуатации)

← Ранее: Раздел 4. Калибровка двупреломляющих призм.

Далее: Раздел 6. Измерение коэффициента преломления и толщины →

Раздел 5. ИЗМЕРЕНИЕ РАЗНОСТИ ОПТИЧЕСКОГО ПУТИ

1. Измерение в поле полос — двупреломляющая призма № 2
2. Измерение в однородном цвете с большим раздвоением изображения — двупреломляющая призма № 3
3. Измерение в однородном дифференциальном поле — двупреломляющая призма № 1

1. ИЗМЕРЕНИЕ В ПОЛЕ ПОЛОС — ДВУПРЕЛОМЛЯЮЩАЯ ПРИЗМА № 2

Этот метод применяется главным образом для исследований тонких волокон и узких обрезков, отдельных клеток и всякого рода овальных объектов (диаметром не более 32 мкм), а также тонких слоев и пленок. Измерение разности оптического пути в самом простом случае, заключается в определении ширины межполосного растояния h' в поле зрения микроскопа и величины смещения d интерференционных полос в изображении исследуемого объекта (рис. 2).

Зная эти величины и длину волны X примененного света, разность оптического пути Ф определяется по формуле: Ф= (d/h') λ (15).

Измерение межполосного расстояния h' и смещения полос d производится посредством окуляра 12 X с микрометрической шкалой (или посредством микрометрического окуляра, поставленного по специальному требованию). Этот окуляр употребляется подобным образом как всякий иной микроскопный окуляр. Однако, прежде чем приступить к измерению, его нужно точно навести на резкость микрометрической шкалы. С этой целью поворачиваем его глазную линзу до тех пор, пока не получится максимально резкое изображение шкалы.

Если исследуемым объктом является волокно, узкий обрезок или какой-нибудь удлиненный объект, то лучше всего установить его (вращая столик) под углом 45° к направлению интерференционных полос (рис. 2). При применении белого света, лучше всего проводить измерение при помощи темной нулевой полосы или первой окрашенной полосы. Выгодно при этом производить отсчет двойной величины d, принимая во внимание расстояние между центрами той самой полосы в одном и другом (обыкновенном и необыкновенном) изображении исследуемого объекта (рис. 2.). Однако таким образом можно поступать, когда исследуемый объект однороден в отношении толщины и коэффициента преломления. В случае неоднородных объектов, измерение разности оптического пути может относиться только к определенному месту, а не ко всему объекту. В таком случае следует установить препарат так, чтобы в требуемом месте однако или другого изображения исследуемого объекта нашёлся центр смещенной полосы, выбранной для измерения.

То же самое можно получить, и даже более удобным способом, передвигая двупреломляюшую призму в поперечном направлении посредством микровинта 15 (рис. 16), в то время как препарат остается неподвижным. Таким же образом следует поступить в случае овальных микрообъектов (рис. 21).

В случае изотропных, растаянутых объектов с поперечными размерами, превышающими величину раздвоения изображения, измерение разности оптического пути можно выполнять только в пределах раздвоенных областей. Поворачивая столик микроскопа, можно получить раздвоение изображений любых береговых областей исследуемого объекта (например, клетки). Так как максимальное значение раздвоения для призмы № 2, дающей поле интерференционных полос составляет 32 мкм (для объектива 10x), то диаметр области, в которой можно измерять в каждом пункте разность оптического пути (применяя поворачивания препарата) составляет 64 мкм. Поясняет это рис. 22.

В случае тонких слоев или пленок, измерения разности оптического пути при применении этого метода можно производить на соответственных узких полосках, уступах или бороздах, устанавливаемых наискось по отношению к направлению интерференционных полос (рис. 23, 24, 25).

 

 

Вышеописанным способом можно производить измерения разницы оптического пути с точностью порядка λ/10. Достижение большей точности требует фотографирования интерференционного изображения для более точного определения па микрофотометре или денситометре максимального затемнения интерфренционных полос. В этом случае можно получить точность измерения разности оптического пути порядка λ/20.

Другой метод измерения разности оптического пути в интерференционном поле заключается в измерении величины перемещения р(р=р2 — p1) двупреломляющей призмы, которое требуется для максимального затемнения нулевой интерференционной полосой того же самого фрагмента в обоих разделенных изображениях исследуемого объекта (рис. 26). Удлиненные объекты как-то: тонкие волокна, узкие полоски и борозды, следует при этом устанавливать параллельно направлению интерференционных полос.

В этом случае, разность оптического пути может быть выражена следующими формулами:

Ф = 1/2 (p - р') λ/h для n > n1  (16 а);

Ф = 1/2 (p + р') λ/h для n р' (16 б);

Ф = 1/2 (р'- р ) λ/h для n

Величина h, которую можно назвать действительной, вытекает из конструкционных данных самой двупреломляющей призмы и определена формулой (1). Для данной длины световой волны она является постоянной величиной и не зависит от кратности увеличения ни объектива, ни окуляра. Значение h и постоянной р' для белого межполосного расстояния монохроматического света с длиной волны λ = 590 нм и λ = 546 нм может быть взято из табл. II или может быть определено вышеописанным способом. Так как значение р' в табл. II подано в микронах, следовательно и перемещение призмы р следует выразить в микронах.

Точность этого метода является порядка λ/30. Он особенно годится для измерения мелких отдельных объектов, изображения которых ещё совершенно разделены.

2. ИЗМЕРЕНИЕ В ОДНОРОДНОМ ЦВЕТЕ С БОЛЬШИМ РАЗДВОЕННОМ ИЗОБРАЖЕНИЯ — ДВУПРЕЛОМЛЯЮЩАЯ ПРИЗМА № 3

Наиболее общим методом измерения разности оптического пути при помощи призм № 3, дающих однородное поле и большое раздвоение изображений, заключается в поперечном перемещении двупреломляющей призмы и приведении окраски одного из раздвоенных изображений к окраске фона поля зрения. При этом наиболее удобно использовать темную полосу нулевого порядка интерференции. Измерение разности оптического пути производится таким образом, что сначала устанавливается для двупреломляющей призмы нулевое положение р0, при котором получается максимальное затемнение фона поля зрения микроскопа (рис. 27а), а затем, передвигая призмы в соответственном направлении в положение P1 максимально затемняется одно из раздвоенных изображений исследуемого объекта (рис. 27b или с). Согласно формулам (3) и (4) разность оптического пути Ф выразится тогда формулой:

Ф = (p1—р0) λ/h   (17), где λ является длиной волны примененного света, h — расстоянием между интерференционными полосами двупреломляющей призмы.

Измерение Ф сводится таким образом к отсчету на барабанах микровинта величины перемещения p1 — р0 двупреломляющей призмы.

Расстояние между двумя интерференционными полосами h определяется способом, описанным выше или принимается по табл. II, если измерения производятся в белом или монохроматическом свете с длиной волны λ = 546 нм и λ = 590 нм. Так как значения h в табл. II приведены в микронах, следует и значение перемещения pt — р0 выразить также в микронах, зная, что цена элементарного деления на подвижном барабане составляет 10 мкм, а на неподвижном барабане 1000 мкм.

Для примера допустим, что измерение проводим в монохроматическом свете с длиной волны λ = 546 им. Отсчитанное на микровипте положение р0 составляет 4 деления на неподвижном барабане и 34 деления на подвижном барабане, а положение Р1— 5 делений на неподвижном барабане и 96,5 на подвижном барабане. Определяя перемещение двупреломляющей призмы № 3 в микрометрах получаем p1 — р0 = 5965 — 4340 = 1625. Тогда разность оптического пути равняется:

Если оба изображения исследуемого объекта совершенно разделены, то более выгодным будет поступать таким образом, что передвигая двупреломляющую призму, затемняем максимально одно изображение, а затем в том же самом месте, второе изображение (рис. 28). В этом случае разность оптического пути выражается формулой:

где р2-p1 является разностью положений двупреломляющей призмы, при которых максимально затемнено сначала одно изображение, а затем второе. Таким же образом можно поступать также тогда, когда изображения не совершенно разделены (рис. 27), но исследуемый объект однороден в отношении толщины и коэффициента преломления и не является необходимым затемнять изображения точно в том же самом месте. В случае, если разность оптического пути Ф исследуемого объекта меньше длины световой волны (Ф

Если в поле зрения микроскопа находится только одно из изображений (например, при измерениях на уступе), то уравнивая яркость этого изображения с фоном поля зрения, получаем половинное значение перемещения р2 — p1 и разность пути Ф вычисляется по формуле: Ф= 2(р1 — p0) λ/h   (20), где p0 отвечает установке призмы на максимально темный фон, а p1 — установке, при которой изображение и фон одинаково светлы. Установка призмы на одинаковую яркость фона поля зрения и изображения исследуемого объекта более чувствительна, чем установка на максимальное затемнение, и поэтому, в некоторых случаях, измерение при помощи этого метода может быть более точным. Такое измерение возможно, однако, только в том случае, если исследуемый объект не дает большой разности оптического пути, чем 1 λ.

Поскольку максимальное значение раздвоения r для призмы № 3 составляет 6,5 мкм, то диаметр зоны, в которой можно вышепредставленными методами производить измерение разности оптического пути, в каждой точке исследуемого объекта составляет 13 мкм (применяя поворот столика). Следовательно он меньше, чем в случае призмы с интерференционными полосами № 2. Однако точность измерений разности оптического пути посредством призмы № 3 значительно больше и в благоприятных условиях может быть равной λ/80.

В случае тонких слоев, плиток или пленок, измерения разности оптического пути посредством призмы № 3 можно производить на соответственно узких полосках, уступах и бороздах с острыми краями, установленных более или менее параллельно преломляющей грани двупреломляющей призмы. Тонкие волокна и продолговатые объекты следует также уставит таким образом.

Вышеописанные методы имеют однако, некоторые отрицательные стороны. Итак, при первом методе, использующем максимальное затемнение сначала одного раздвоенного изображения, а затем второго, визуальная оценка максимального затемнения изображения является до некоторой степени субъективной. Вытекает это из того, что человеческий глаз не является особенно чувствительным к воспринятию минимальной яркости (максимального затемнения) поля или его фрагмента.

Второй метод, заключающийся в уравнивании яркости одного, а затем второго изображения с яркостью фона поля зрения, может применяться только в случае очень тонких однородных объектов. В биологических исследованиях, при которых выступают неоднородные препараты, может найти применение только первый метод.

Наоборот, человеческий глаз очень хорошо оценивает равенство яркости двух соседних полей. На этом основании построена специальная насадка с полутеневым окуляром, делающая возможным произведение измерений разности оптического пути более точным образом, чем при применении метода максимального затемнения раздвоенных изображений.

Основным элементом насадки является полуволновая пластинка, помещенная в предметной плоскости окуляра. Исследуемый объект устанавливается посредством передвижения столика так, чтобы одна из граней полоски полуволновой пластинки разделяла на две части раздвоенные изображения этого объекта.

Измерение разности оптического пути производится путем поперечного передвижения призмы w1 и установки её в двух положениях, при которых яркость одного раздвоенного изображения, а затем второго изображения в пространстве полуволновой пластинки и за её пределами является такой же самой. Производится отсчет обоих положений Р1 и Р2 призмы и высчитывается разность оптического пути по формуле (18).

При этом, микроскопная насадка с полутеневым окуляром сконструирована таким образом, что делает возможным одновременное наблюдение интерференционного изображения исследуемого объекта и наблюдение выходного зрачка объектива. Для этой цели служит включаемая отрицательная линза. При включенном положении этой линзы насадка дает возможность производить наблюдение интерференционного изображения и уравнивания его яркости. Применение микроскопной насадки с полутеневым окуляром делает возможным измерение разности оптического пути с точностью порядка λ/500.

Примечание: применяя насадку с полутеиевым окуляром следует выключить анализатор А (рис. 1). Роль этого анализатора выполняет анализатор в насадке с полутеневым окуляром.

3. ИЗМЕРЕНИЕ В ОДНОРОДНОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОМ ПОЛЕ — ДВУПРЕЛОМЛЯЮЩАЯ ПРИЗМА № 1

Как известно, разность оптического пути ψ между обыкновенной волной и необыкновенной в дифференциальном интерференционном изображении не выражает непосредственно разности пути Ф в предмете, а только градиент этой разности в направлении раздвоения интерференционных волн (рис. 8).

В этом случае, нельзя разности оптического пути ψ в изображении отождествлять с разностью пути, вызванной иследуемым предметом. Измерение разности оптического пути ψ в дифференциальном изображении также наиболее удобно производить в однородном темном цвете нулевого порядка интерференции. При наводке двупреломляющей призмы на однородный темный фон поля зрения (нулевое положение призмы р0), в изображении данного предмета (с размерами превышающими значение раздвоения r) почти всегда выступает такое место (или несколько мест), в котором цвет такой же самый, как цвет фона поля зрения (смотри рис. 47). В этих местах фронты интерференционных волн взаимно прилегают (касаются один другого) и сдвит фазы равен нулю. Желая измерять ψ в любом ином месте исследуемого объекта, следует переместить двупреломляющую призму в такое положение p1, при котором это место принимает максимально темную окраску.

Тогда разность оптического пути в этом месте выразится зависимостью: ψ = (p1-p0) λ/h  (21).

Следовательно, измерение ψ сводится, как и прежде, к отсчету при помощи микровинта перемещения призмы P1-Р0. Расстояние между двумя интерференционными полосами h определяется способом, описанным выше.

Измеряя разность оптического пути в дифференциальном изображении можно затем определить падение (градиент) этой разности пути в предмете (формула 12), угол соприкосновения (формула 13), кривизну (формула 14), коэффициент преломления света (формула 13) и ряд иных величин.

При благоприятных условиях наблюдения, при применении этого метода можно достичь точности измерения разности пути ψ порядка λ/250.

 

← Ранее: Раздел 4. Калибровка двупреломляющих призм.

Далее: Раздел 6. Измерение коэффициента преломления и толщины →